Schizosaccharomyces pombe'de gua1 geninin Knock-out tekniği ile delesyona uğratılması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: İstanbul Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Fen Fakültesi Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2014
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Merve Yılmazer
Danışman: Semian Karaer Uzuner
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu çalışmada tek hücreli ve ökaryotik bir model organizma olan Schizosaccharomyces pombe'de guanozin monofosfatın (GMP) de novo biyosentezinin ilk aşamasını katalizleyen inozin monofosfat dehidrogenaz (IMPDH) enzimini şifreleyen gua1 geninin "knock-out" tekniği ile delesyona uğratılması amaçlandı. Schizosaccharomyces pombe'de PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) temelli gen hedefleme yöntemi esas alınarak PCR tekniğiyle "knock-out" kaseti oluşturuldu ve bu kaset Schizosaccharomyces pombe'ye transforme edildi. Çalışmada yabani ırk (972h-) , ura4h- mutant ırkı ve diploid Schizosaccharomyces pombe ırkları kullanıldı. pFA6-kanMX4 plazmidi taşıyan E.coli DH5α ırkından pFA6-kanMX4 plazmidi izole edildi ve "knock-out" kaseti için kalıp olarak kullanıldı. Schizosaccharomyces pombe'nin 972h – (yabani ırk) genom DNA'sı kalıp olarak kullanılarak gua1 geninin iki yanında bulunan 653 ve 285 bç'lik diziler elde edildi ve pFA6 plazmidi kullanımı ile kanamisin direnç genini de içeren kaset meydana getirildi. 653 ve 285 bç'lik diziler ilk PCR sonrası oluşturulurken kaset ikinci PCR sonrasında elde edildi. Lityum asetat yöntemiyle transformasyon sonrası bu kasetin Schizosaccharomyces pombe genomunda gua1 geni içindeki bölgeye homolog rekombinasyonla girişi amaçlandı. Transformasyona uğratılmış hücreler, "geneticin" içeren YEA besiyerine ekildi. Böylece kaseti genomuna almış olan 972h-, ura4h- mutantı ve diploid koloniler seçildi. Seçilim sonrası diploid kolonilerin haploidizasyonu gerçekleştirildi. Yabani ırk (972h-), ura4h- mutant ırkı ve haploid koloniler "geneticin" içeren YEA, YEA, guanin içeren MMA, urasil ve guanin içeren MMA ve MMA seçici besiyerlerine ekildi. Bu aşamada xi guanin mutantı olabilecek koloniler belirlendi. Son olarak delesyonun doğru bölgede gerçekleşip gerçekleşmediği ise koloni PCR ile kontrol edildi. Koloni PCR sonrası bir kolonide beklenen sonuç elde edildi.