İmmobilize PETaz Enzimi ve Probiyotik Mikroorganizmalar Kullanılarak Gökkuşağı Alabalığında Oncorhynchus mykiss MikroNano Plastik Parçacık Giderimi ve Büyümenin Zenginleştirilmesi
Yıldız M. (Yürütücü), Sarı E., Binay B., Yıldırım D., Gündüz Ergün B., Metin Ö., et al.
Yükseköğretim Kurumları Destekli Proje, BAP Araştırma Projesi, 2026 - 2029
- Proje Türü: Yükseköğretim Kurumları Destekli Proje
- Destek Programı: BAP Araştırma Projesi
- Başlama Tarihi: Ocak 2026
- Bitiş Tarihi: Ocak 2029
Proje Özeti
Sucul ekosistemlerde, hem fiziksel hem de kimyasal ciddi tehdit oluşturan mikroplastikler, özellikle besin zinciri aracılığıyla balıkların sindirim sistemine geçiş yapmaktadır. Bilimsel araştırmalar, mikroplastiklerin sadece sindirim sistemi ile sınırlı kalmadığını, aynı zamanda karaciğer gibi iç organlara ve kas dokularına da ulaşabildiğini göstermiştir. Mikroplastiklerin balık metabolizmasında fiziksel tıkanmalara yol açtığı, bağışıklık sistemini baskıladığı ve buna bağlı olarak büyüme, üreme ve genel sağlık üzerinde olumsuz etkiler yarattığı bilinmektedir.
Ayrıca, balıklarda biriken mikroplastikler sadece ekosistemi değil, bu balıklar ile beslenen başta insanlar olmak üzere tüm canlılar da doğrudan mikroplastiklere maruz kalmaktadır. Mikroplastiklerin yüzeylerinde çeşitli toksik kimyasalları taşıma potansiyeli, bu kimyasalların da vücuda geçişini kolaylaştırmakta ve sağlık risklerini arttırmaktadır. Dolayısıyla, balıklarda mikroplastik birikiminin azaltılması ya da biriken mikroplastiklerin vücuttan atılmasını yönelik stratejilerin geliştirilmesi kritik bir önem kazanmıştır. Bu kapsamda, mikroplastiklerin balık vücudundan nasıl atılabileceği konusunda bazı yaklaşımlar geliştirilmeye çalışılmıştır. Bu yaklaşımlardan, balıkların sindirim sistemini uyaracak özel yem katkıları ile mikroplastiklerin daha hızlı bir şekilde dışkı yoluyla atılmasını sağlayacak yem katkıları, sindirim sistemi içerisinde mikroplastikleri parçalayabilen ya da etkisiz hale getirebilen faydalı bakterilerin kullanıldığı mikrobiyal arıtma yöntemleri ve biyoteknolojik uygulamalar öne çıkmaktadır. En çok dikkat çeken yaklaşım ise, canlıda olumsuz yan etkilere yol açmadan, doğa ile uyumlu biyoteknolojik yöntemlerin kullanımıdır. Özellikle PET türü plastikleri parçalayabilen enzimlere dayalı biyoteknolojik çözümler, hem çevre dostu nitelikleri hem de potansiyel endüstriyel uygulamaları nedeniyle büyük önem taşımaktadır.
Önerilen projenin ilk aşamasında, Kibdelosporangium aridum PET parçalayıcı enzimi (KaPETaz) için yapısal ve hesaplamalı analizler gerçekleştirilecektir. Homoloji modelleme, çoklu dizi hizalaması ve PyMOL/Discovery Studio yazılımları kullanılarak enzimin 3 boyutlu yapısı oluşturulacak, aktif bölge ve substrat bağlama cepleri analiz edilecek ve katalitik aktiviteyi artırabilecek potansiyel mutasyon noktaları belirlenecektir. Belirlenen mutasyonlar protein mühendisliği yaklaşımlarıyla uygulanacak ve in silico analizler ile stabilite, katalitik özellikler ve substrat etkileşimleri değerlendirilecektir. Kodonu optimize edilmiş gen dizisi içeren rekombinant plazmid, E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transforme edilecek ve yüksek verimli heterolog protein ifadesi sağlanacaktır. Üretilen mutant KaPETaz, saflaştırma adımlarından geçirilerek sodyum dodesil sülfat–poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile doğrulanacak, Bisinkoninik asit yöntemi (BCA) ile protein konsantrasyonu belirlenecektir. Ayrıca, mutant KaPETaz’ın kinetik karakterizasyonu gerçekleştirilecektir. Bu aşama sonunda, biyoreaktörlerde kontrollü üretim yapılacak ve immobilizasyon teknikleriyle enzim kararlı ve tekrar kullanılabilir form kazanacaktır. Böylece, KaPETaz enziminin hem endüstriyel ölçekte üretimi hem de uygulama potansiyeli için sağlam bir temel oluşturulacaktır.
Projenin ikinci aşamasında, probiyotik Saccharomyces boulardii (S. boulardii) mayası CRISPR/Cas9 aracılı gen düzenleme teknikleriyle PETaz enzimi ekspresyonu için yeniden tasarlanacak ve balık beslemede kullanılabilecek plastik parçalama potansiyeline sahip sentetik biyoloji araçlarıyla geliştirilmiş probiyotik maya suşu elde edilecektir. Bu amaçla ilk olarak antibiyotik direnç geni kullanımının önlenmesi için oksotrofik S. boulardii suşları geliştirilecektir. Balığın intestinal sisteminde aktivite gösterecek FAST PETaz enzim geni S. boulardii’nin kodon tercihlerine göre optimize edilecek ve güçlü konstitütif TDH3 promotoru altında üretimi için ekspresyon kasetleri tasarlanacaktır. Ekspresyon kaseti çift-yönlü olacak şekilde tasarlanacak bir yönde PETaz ekspresyon kaseti taşırken diğer yönde oksotrofi replasman kasetini içerecek şekilde kimerik yapıda geliştirilecektir. Tasarlanan PETaz ekspresyon ve oksotrofi replasman kasetleri taşıyıcı vektör içine klonlanarak E. coli DH5?’ya transformasyonu gerçekleştirilecektir. Doğrulanan ekspresyon kasetleri, CRISPR/Cas9 genom düzenleme aracı kullanılarak S. boulardii genomuna entegre edilecek ve PETaz ekspresyonu gerçekleştiren stabil S. boulardi suşları oluşturulacaktır. Mühendislikle geliştirilecek S. boulardii’nin hem probiyotiklerin balıklara sağladığı beslenme ve intestinal fizyolojik etkiyle ilgili avantajları sunması hem de aynı anda intestinal sistemde üretilecek PETaz enzimi ile hedeflenen su ürünlerinde plastiklerin parçalanması amaçlanmaktadır.
Bu araştırmada, dünyanın birçok ülkesinde olduğu gibi Türkiye’de de önemli düzeyde yetiştiriciliği yapılan gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) araştırma balığı olarak kullanılacaktır. Bu alandaki araştırmalar; gerek ilgili literatürde gerekse sürdürülebilir akuakültür, güvenli gıda arzı ve temiz su kaynaklarının korunması konularında önemli katkılar sağlaması beklenmektedir.