Obezite Genetik Risk Panelinin Analizi İçin Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyon Ve Tam Otomasyona Dayalı Bir Sistem Geliştirilmesi


Zeybek Ş. Ü. (Executive), Aksakal N., Ergen H. A., Gürol A. O., Yaylım İ.

TUBITAK Project, 2018 - 2021

  • Project Type: TUBITAK Project
  • Begin Date: March 2018
  • End Date: March 2021

Project Abstract

Projenin amacı, obezite riskiyle ilişkili polimorfizmlerin tespiti ve gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) tabanlı yöntemlerin yüksek cihaz maliyeti dezavantajının giderilmesi için, en az DNA dizi analizi kadar hassas sonuçlar verebilen, rekombinaz polimeraz amplifikasyon (RPA) tabanlı bir yöntem ve yöntemi gerçekleştirecek cihazın geliştirilmesidir.

Projede 32 adet genle ilişkili obeziteye yatkınlık, obezite gelişimi ve obezitenin metabolik süreçlerle bağlantısını bildirebilecek polimorfizmlerden oluşan bir panel belirlenmiştir. Vücut kitle indeksi (VKI) ve genetik risk skorlarını ilişkilendiren çalışmaların çoğunda, projedeki 32 adet Tek Nükleotid Polimorfizmi (SNP) hedeflenmektedir.

Çalışmada 32 farklı SNP’yi hedefleyen oligolar tasarlanmış olup RPA ve qPCR reaksiyonlarında kullanılmışlardır. RPA ve qPCR yöntemlerinin her ikisinin de mutasyon taramasında tespit limitinin 1 kopya hedef/µL olduğu ve eşdeğer sonuçlar verdikleri belirlenmiştir.

200 tam kan örneğine DNA dizi analizi ve projede geliştirilen RPA tabanlı analiz ve qPCR tabanlı analiz uygulanmıştır. Örnekler, 50’şer hastanın VKI’ne göre Obez olmayan (VKI<25), Kilolu (25≤VKI<30), Obez (30≤VKI<35) ve Morbid obez (35≤VKI) olarak gruplandırılmıştır.

Nükleik asit (NA) ekstraksiyonu projede geliştirilen NA ekstraksiyon robotuyla gerçekleştirilmiştir. RPA, qPCR ve DNA dizi analizlerindeki sonuçlar %100 uyum göstermiştir. RPA analizi 25, qPCR analizi 55 dk’da sonuçlanmıştır. Geliştirilen RPA yöntemi, qPCR analizindeki gerekli süreyi %45 oranında azaltmıştır. RPA tek sıcaklıkta gerçekleştirilebildiğinden, analizler qPCR’a göre çok daha basit bir cihazla sonuçlandırılabilmiştir.

RPA veya DNA amplifikasyonu temelli bir yöntemle obeziteyle ilgili mutasyon taramalarında ilk defa 32 hedef genin birlikte çalışıldığı kapsamlı bir panel, bu projede oluşturulmuştur. Böylelikle, mutasyon taramalarında cihaz maliyetlerinin düşürülerek, obezite dahil birçok genetik risk bağlantılı hastalığın, toplum tabanlı yaygın çalışılmasının önü açılmıştır.

SNP ilişkili herbir VKİ arttırıcı alel için etki 0,06-0,4 kg/m² arasında değişmektedir. Çalışmamızdaki sonuçlar da literatürle uyumluluk göstermiştir. Katılımcıların mutasyon profilleri ve VKİ değerleri arasındaki korelasyonda, istatistiksel olarak önemli bir ilişki bulunmuştur (r=0,628, p=0,00; istatistiksel önem p<0,05).