Protein etkileşimlerini tanımlamak, protein fonksiyonlarını belirlemede önemli bir adımdır. Bilinmeyen bir proteinin fonksiyonu, bu nedenle, anotasyonlu etkileşim partnerlerinin tanımlanmasından çıkarılabilir. Tipik olarak, maya ikili-hibrid sistemi (Y2H), protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için en yaygın kullanılan genetik testtir. Mikoplazmalar, genomu tamamen dizilen ilk organizmalardan biridir ve minimal hücreler ile sentetik biyolojiyi çalışmak için ilginç bir modeldir. Ancak mikoplazmalarda protein- protein etkileşimlerini incelemek için kullanılan başarılı bir Y2H sistemi bulunmamaktadır. Bu çalışmada, insan patojenik bakterisi Mycoplasma pneumoniae kullanarak mikoplazmalar için kullanılabilir başarılı bir Y2H sistemi geliştirme ve uygulama hedeflenmiştir. İlk denemelerde, M. pneumoniae'nin hareket mekanizması ve hücre iskeleti bütünlüğünü korumada görevli olduğu bilinen proteinler olan P1 adhezin (MPN141), HMW1 (MPN447) ve HMW2 (MPN310) arasındaki etkileşimlere odaklanılmıştır. Başarılı bir Y2H sistemi geliştirmek için önemli iki ana unsurun olduğu bulunmuştur. İlk unsur, türler arası kodon kullanım farklılıklarına dikkat ederek kodon uyumluluğunu sağlamasıdır. UGA kodonu prokaryotlar ve ökaryotlar boyunca bir durdurma kodonu olarak kodlandığı yerde mikoplazmalarda triptofan amino asidi olarak kodlanır. İlgili hedef gen dizilerinde UGA kodonu UGG olarak düzenlenmiştir. İkinci unsur ise etkileşimleri incelenecek proteinlerin ikincil yapıları dikkate alınarak Y2H vektörlerinin tasarlanmasıdır. P1 adhezin, HMW1 ve HMW2 proteinlerinin ikincil yapıları incelenerek, Y2H vektörleri tasarlanırken hedef proteinlerin transmembran segmenti içermemeleri ve kıvrımlı-bobin, α-sarmal ve β- levhaların bozulmayacak şekilde fragmentlere ayrılmasına dikkat edilmiştir. Sonuçlarımız, P1 adhezin en uç C-terminal bölgesi ile HMW1 ve HMW2 proteinlerinin C-terminal bölgeleri arasında etkileşim olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, M. pneumoniae'de Y2H'nin ilk başarılı denemesi olup, diğer mikoplazma türlerinde yapılacak denemeler için literatüre katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
Defining protein-protein interactions is a crucial step in elucidating protein functions. Consequently, the function of an uncharacterized protein can be determined by recognizing its known interaction partners. The yeast two- hybrid (Y2H) system is commonly regarded as the most popular genetic assay for identifying protein-protein interactions. Mycoplasmas are among the first organisms with fully sequenced genomes and serve as intriguing models for studying minimal cells and synthetic biology. However, a successful Y2H system has not yet been established to examine protein-protein interactions in mycoplasmas. In this study, we aimed to develop and implement a viable Y2H system for mycoplasmas using the human pathogenic bacterium Mycoplasma pneumoniae. The initial trials concentrated on examining the interactions among proteins that are recognized for their roles in the motility of M. pneumoniae and the preservation of cytoskeletal integrity, particularly the P1 adhesin (MPN141), HMW1 (MPN447), and HMW2 (MPN310). Our findings indicate that two primary factors are essential for successfully developing of a Y2H system. The first factor pertains to ensuring codon compatibility by considering differences in interspecies codon usage. While the UGA codon encodes a stop codon across prokaryotes and eukaryotes, in mycoplasmas, it is translated as tryptophan. Thus, the UGA codon in the relevant target gene sequences has been modified to UGG. The second factor involves designing Y2H vectors by considering the secondary structures of the proteins to be examined for interactions. By analyzing the secondary structures of P1 adhesin, HMW1, and HMW2 proteins, it was ensured that the target proteins do not contain transmembrane segments and that the structures of the coiled- coil, α-helix, and β- sheet were preserved when fragmented. Our results demonstrate an interaction between the extreme C-terminal region of P1 adhesin and the C-terminal regions of HMW1 and HMW2 proteins. This study represents the first successful attempt at Y2H in M. pneumoniae, and it is anticipated that it will contribute to the literature for further experiments on other mycoplasmal species.
