Research Information System
18. Uluslararası Türkiye Hemofili Kongresi, İskele, Cyprus (Kktc), 19 - 22 September 2021, pp.75
Amaç: Hemofili A faktör VIII (FVIII)
eksikliğine bağlı ortaya çıkan, X’e bağlı kalıtılan herediter bir hastalıktır.
Günümüzde tedavide kullanılan plazma veya rekombinant FVIII (rFVIII)
konsantrelerine bağlı en önemli sorunlar yarı ömrün kısa olması nedeniyle
infüzyonların tekrarlanması gerekliliği ve hastaların %25-30‘unda FVIII’e karşı
nötralize edici antikorların (inhibitör) varlığıdır. İnhibitör gelişiminde intron 22 inversiyonu,
delesyon veya nonsense mutasyon gibi FVIII geninde oluşabilecek mutasyonlar
bilinen önemli nedenlerdendir. Bunlar dışında major histokompatibilite
(MHC)-II, interlökin (IL)-10 ve tümor nekroz faktör (TNF)-alfa gibi sitokinleri
kodlayan regulatuvar genlerde oluşabilecek polimorfizm ve CTLA-4 reseptörü de
etkili diğer faktörlerdir. Yapılan hayvan çalışmaları ile, CD4+CD25+ Thücreleri aracılığıyla FVIII‘e
karşı tolerans geliştiği ve Treg (CD3+CD4+CD127-CD25+Foxp3+) hücrelerinin uzun
süreli toleranstaki rolü gösterilmiştir.
Bu çalışmada,
inhibitör gelişmiş ve inhibitörü negatif Hemofili A hastalarında rFVIII ile
uyarılmış CD4+CD25+ T hücre ile Treg hücre yüzdelerinin gösterilmesi;
bu hücrelerden sekrete edilen TNF-alfa, IFN-gama, IL-2, IL-10, IL-13, TGF-beta sitokin
düzeylerinin inhibitör
gelişimi patogenezindeki rollerinin ortaya konulması, bu sayede de inhibitör
pozitif hastalara uygulanacak spesifik
immün tedaviye katkıda bulunulması amaçlanmaktadır.
Yöntem: Çalışma
grubu; (I) İnhibitör gelişmiş Hemofili A hastası (n=10), (II) İnhibitör negatif
Hemofili A hastası (n=10), (III) hastalarla yaş ve cinsiyet uyumlu
sağlıklı kontrol grubundan (n=10) oluşmaktadır.
İnhibitör
varlığı ve/veya düzeyi klasik Bethesda testi ile yapıldı. Periferik kan
mononükleer hücre (PKMH) izolasyonu için; heparinli tüpe alınan 10 ml kan
örneği 2 saat içinde laboratuvara ulaştırıldı. Kan örnekleri (1:1) steril PBS çözeltisi
ile 2000 rpm’de oda ısısında 20dk santrifüj edilip PKMH ayrıldı ve zenginleştirilmiş RPMI
kültür medyumunda 1x106PKMH/ml olacak şekilde süspanse edildi. Elde
edilen PKMH; uyarılmamış, rFVIII ile uyarılmış ve fitohemaglutinin (PHA) ile
uyarılmış (pozitif kontrol) olarak 120 saat kültüre edildi. Kültür sonrası süpernatantlar (600 µL) toplanarak
-80°C’de saklandı ve ELISA yöntemi ile TNF-alfa,
IFN-gama, IL-2, IL-10, IL-13, TGF-beta sitokin ölçümleri yapıldı. Süpernatantları toplanan hücreler, 0. gündeki
gibi hücre yüzeyleri CD4, CD25, CD127 moleküllerine karşı florokrom işaretli
monoklonal antikorlar ile işaretlendi ve hücre proliferasyonu flow sitometri
cihazı ile incelendi. Sonuçlar % proliferasyon veya stimülasyon indeksi olarak
değerlendirildi.
Bulgular: Flow sitometri ile 0.
günde CD4+CD25+ T hücre oranı; inhibitör(+) grupta %1.21±0.63, inhibitör(-)
grupta %1.99±0.98, kontrol grubunda %0.54±0.18 bulundu. İnhibitör(+) grup,
kontrol grubuna göre ve inhibitör(-) gruba göre anlamlı olarak farklılık
gösterdi (p=0.003, 0.031). Treg hücre oranları ise inhibitör(+) grupta %14.27±4.46,
inhibitör(-) grupta %14.85±8.95, kontrol grubunda %11.57±1.27 saptandı. İnhibitör(+)
grubun Treg hücre düzeyleri, inhibitör(-) grup ve kontrol gruplarıyla anlamlı
farklılık göstermedi.
Sonuç: Çalışmada 3 koşulda gerçekleşen
inkübasyon sonrası proliferasyon veri analizi ve hücre kültür
süpernatantlarında sitokin düzeyi ölçümleri ileri tarihte yapılacaktır. Veriler
tam elde edilememiş olmakla birlikte, gruplar arasında CD4+CD25+
T hücre düzeyleri arasındaki anlamlı faklılıklar, bu hücre grubu ve bu
hücrelerden eksprese edilen sitokinlerin inhibitör gelişiminde rolü
olabileceğine işaret etmektedir. Patogenezin aydınlatılması sayesinde bu
hastalarda inhibitör gelişiminin önlenmesi ve alternatif tedavi olasılıkları
ile yaşam kalitelerinin arttırılmasına katkıda bulunmaya çalışılacaktır.