Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: İstanbul Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Fen Fakültesi Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: INJI SHIKHALIYEVA
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Gülruh Albayrak
Özet:
Doktora tezinde, Fusarium mikotoksinlerinden deoksinivalenolün (DON) insan mezenkimal kök hücrelerinin (MKH) sağ kalımı ve çoğalması üzerindeki olası etkileri hücresel ve moleküler yaklaşımlarla araştırıldı. Diş pulpası kök hücreleri (DPKH), 6 kadın ve 6 erkek bireyden çekilen gömük sağlıklı 20 yaş dişlerinden izole edildi. İğsi morfolojileri Giemsa boyaması ile gösterilen hücrelerin ikilenme süresinin 32 saat olduğu belirlendi. Beşinci pasaja (P5) ulaşan DPKH’lerin karakterizasyonu akış sitometrisinde MKH pozitif yüzey markırlarından CD90, CD29 ve CD73, negatif yüzey markırlarından CD45 ve CD34 taranarak gerçekleştirildi. Pozitif yüzey markırlarının %95-99.9, CD45’in de %0.05-0.9 değer aralığında DPKH’lerde taşındığı belirlendi. CD34’ün %2.57-83.86 değer aralığında belirlenmesi bu markırın DPKH’lerde çok geniş değer aralığında taşınabileceğini gösterdi. İzole edilen DPKH’lerin multipotensi özellikleri, osteojenik ve adipojenik farklılaşmaları teşvik edildikten sonra alizarin red S boyaması ile gösterilen kırmızı renkteki mineralizasyon bölgeleri ve oil red O boyaması ile gösterilen hücre içi yağ damlacıkları ile ortaya kondu. DON’un DPKH’lerin sağkalımı üzerindeki etkisi MTT analizi ile araştırıldı. Öncelikle asetonitrilin 0.4-3.2 μg/ml konsantrasyon aralığında DPKH’ler üzerinde toksik etkili olmadığı belirlenerek mikotoksinin çözücüsü olarak uygunluğu ortaya kondu. DON’un toksik etkisi ile hücre yoğunluğu arasındaki ilişki %50 ve %80 yoğunluktaki DPKH P5 kültürlerine 0.25-4 µg/ml aralığında DON uygulaması ile araştırıldı. %50 hücre yoğunluğunun toksisite çalışması için daha uygun olduğu gösterildi. %50 yoğunluktaki DPKH P5 kültürleri DON’un 0.25-2 µg/ml dozlarına 24, 48, 72 ve 96 saat süre ile maruz bırakılarak mikotoksinin maksimum inhibitör konsantrasyonunun yarısını temsil eden dozu (IC50) MTT analizi ile 0.46 µg/ml olarak hesaplandı. IC50 dozunun farklılaşma sürecini tamamlamış L929 stabil hücre hattı üzerinde ise sadece %30 hücre inhibisyona neden olduğu gösterildi. DPKH’lerin ikilenme süresinden dolayı mikotoksinin sağkalım ve bölünmesi üzerindeki etkilerinin ilk 48 saat içerisinde çalışılması gerektiği sonucuna ulaşıldı. DON IC50’nin ilk 48 saat içerisinde DPKH’lerin ölümüne yol açmadığı akridin turuncusuetidyüm bromür boyaması sonrası fluoresan mikroskobu incelemesi ve anneksin V-propidium iyodür boyaması sonrası akış sitometri analizi ile gösterildi. DON uygulanmış kültürlerde kontrole benzer şekilde canlı hücre oranları %90’nın üzerinde, apoptotik ve nekrotik hücre oranları ise %5’in altında bulundu. Kontrol ile deney grubunun hücre canlılığı arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı t-testi ile gösterildi. Apoptoz süreci ile ilgili proapoptotik Bax, antiapoptotik Bcl2 ve Bcl-xL, hücresel yapıların yıkımını koordine eden Cas3 genlerinin anlatım düzeyleri qPZR analizi ile ve Cas3 proteininin düzeyleri Western blot analizi ile araştırıldı. 24. saatte deney grubunda Bcl2 anlatım düzeyinin yaklaşık 2 kat arttığı, Bax, BclxL ve Cas3 anlatım profillerinin ise kontrol ile benzerlik gösterdiği ve aralarında istatistiksel olarak fark olmadığı saptandı. 48. saatte Bcl-xL anlatımı kontrole kıyasla azalırken, Bcl2, Bax ve Cas3 gen anlatımları arasındaki farkın anlamlı olmadığı saptandı. Cas3 protein düzeyleri arasında da istatistiksel olarak fark saptanmadı ve IC50 dozunun DPKH kültürlerinde apoptoza ve nekroza neden olmadığı desteklendi. 2’,7’-diklorofloresin diasetat (DCF-DA) boyaması sonrası DON IC50 dozunun ilk 48 saat içerisinde DPKH’lerde oksidatif stres düzeyini önemli ölçüde arttırmadığı fluoresan mikroskobunda izlendi ve kontrol ile deney grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı spektroflorometrik ölçüm ile belirlendi. Ancak oksidatif stres sürecinde rol alan antioksidan enzimleri kodlayan CAT gen anlatımının kontrole göre azaldığı, SOD2 anlatımının ise arttığı saptandı. PI boyaması sonrası akış sitometrisi analizi ile DPKH kültürlerinde 24. saatte, G0, G1, S ve G2/M fazlardaki kontrol ve deney grubu hücre oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı farkın olmadığı, 48. saatte ise deney grubunda G2/M fazındaki hücre oranlarının kontrole kıyasla (%8.2±0.03) önemli ölçüde (%31±0.06) arttığı saptandı. qPZR analizi, 48. saatte hücre döngüsü kontrol noktalarında görevli Cdk1, Siklin B1 ve p53 genler arasından p21’in anlatım düzeyinde 6 katlık artışı belirlemeyi sağladı. Western blot analizi, 24 saatte mikotoksin maruziyetinin her iki fraksiyonda da p21 oranını azalttığını ortaya koydu. Bununla birlikte, 48 saatlik maruz kalma, sitoplazmik fraksiyonda yaklaşık 3.5 kat azalmaya, nükleer fraksiyonda ise 6 kat artışa yol açtı. Bulgular DON’un hücre döngüsünü p53’ten bağımsız p21 yoluyla G2/M fazında tutukladığını ortaya koydu. Tez çalışmasında ilk defa DON’un DPKH’lerin osteojenik ve adipojenik farklılaşmasına etkileri araştırıldı ve farklılaşmanın teşvik edilmediği ortamda DON’un p21 ile birlikte osteojenik (BMP2) ve adipojenik (C/EBPβ) farklılaşma markırlarının anlatımını yükselttiği belirlendi. Çalışmadan elde edilen bulgular, MKH toksisite çalışmasında hücre yoğunluğunun önemini göstermesinin yanı sıra, hücre hattı ile farklılaşmamış primer kültür arasındaki farkı da ortaya koydu. Aynı zamanda bu çalışma, DON’un MKH’lerin sağkalımı, proliferasyonu ve farklılaşması süreçleri üzerindeki etkileri ile ilgili önemli veriler sundu. Doktora tezi, temel bilimlere önemli katkı sağlamakla beraber, mikotoksinlerin dokularda rejenerasyondan sorumlu ve hücre terapisinde kullanılan MKH’lerin üzerindeki toksik etkileri ile ilgili, aynı zamanda uzun süreli DON etkisinin DPKH’lerin farklılaşması üzerindeki etkisinin taranması, DON’un DPKH’lerin nöronlara farklılaşma potansiyelleri kullanılarak nörojenik farklılaşma sürecindeki etkilerinin taranması, p21 bağımlı etkilerinin mitokondri yolağı üzerinden aydınlatılabilmesi yolunda yeni projelere zemin hazırlaması açısından büyük önem taşımaktadır.