Hücre Kültüründe Apoptozun Moleküler Mekanizmaları Üzerine Gama Radyasyonunun Etkileri
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: İstanbul Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Fen Fakültesi Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2015
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Walid Khalilia
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Fatma Gül ÖZCAN
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:İyonlaştırıcı radyasyon katı tümörlerin tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Tedavi sürecinde tüm kanser hastalarının yarısından fazlası radyoretapi görmektedir. Bununla birlikte, radyoterapinin etkisini apoptoz uyarımı ile gerçekleştirip gerçekleştirmediği bilinmemektedir. Bu nedenle, çalışmamızda gama radyasyonunun serviks karsinoması kökenli ve farklı radyoduyarlılığa sahip kanser hücre soylarında apoptoz sinyal yolağında görev alan özgün genlerin ifadesini uyarıp uyarmadığının belirlenmesi amaçlamıştır. Bu bağlamda, farklı radyoduyarlılıktaki kanser hücrelerinde ifadesi artan veya azalan genlerin tanımlanması kanser dinamiğinin daha iyi anlaşılması, serviks kanseri biyobelirteçleri ve tedavi hedeflerinin belirlenmesi ve radyoduyarlılık mekanizmasının aydınlatılmasına önemli katkılar sağlayacaktır. C-4 I ve HeLa serviks karsinoma hücreleri beş farklı dozda (0, 2, 8, 16, 32 ve 64 Gy) gama radyasyonuna maruz bırakılmış ve beş farklı zaman diliminde (0, 24, 48, 60 ve 72 saat) inkübasyona bırakılmıştır. HeLa hücelerinin çoğalması MTT yöntemi ile ölçülmüştür. Apoptotik indeks (AI) apoptoz ile ilişkili morfolojik özellikler floresan mikroskobunda DAPI ile değerlendirilmiştir. Ayrıca, apoptotik genlerin ifadesi mikrodizi ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon (qRT-PCR) yöntemi ile saptanmıştır. Ayrıca, yukarı ve aşağı regüle olan genlerin ifadesi için gen ontoloji ve yolak analizleri yapılmıştır. Önemli işlevlere sahip olan genler ve yolak analizleri sırasıyla kat değişim (FC) ve p değeri hesabına dayalı olarak belirlenmiştir (p < 0.05 ve FC ≥ ±2). Sonuçlar, doza ve zamana bağlı olarak gama radyasyonunun C-4 I ve HeLa hücrelerinin çoğalmasını anlamlı ölçüde azalttığını göstermiştir. C4-I ve HeLa hücre soyları arasında önemli bir farklılık gözlenmiştir (p < 0.01). Çalışmamızda HeLa hücrelerinin radyodireçli olmasına karşın, C-4 I hücrelerinin radyoduyarlı olduğu gösterilmiştir. C-4 I ve HeLa hücreleri için sırasıyla 16 Gy ve 32 Gy değerleri hücrelerin %50'sini çoğalmasını öldüren dozu (IC50) olarak belirlenmiştir. Apoptotik morfolojinin gama radyasyonuna maruziyet süresine ve dozuna bağlı olarak arttığı saptanmıştır. C-4 I ve HeLa hücreleri için sırasıyla 16 Gy ve 32 Gy gama radyasyonu uygulanması sonrasında optimum AI değerleri 60. saatte belirlenmiştir. Mikrodizi sonuçları, farklı veri analiz yöntemlerinin kullanılması ile normalize edildi ve filtrelendi. Hiyerarşik kümeleme, 47.071 filtrelenmiş prob üzerinde uygulandı. HeLa hücrelerinde 343 genin ifadesi önemli ölçüde değişmiştir. Bu genlerden, 150 genin ifadesi yukarı regüle olurkan, 193 genin ifadesi de aşağı regüle olmuştur. Bununla birlikte, C-4 I hücrelerinde 317 genin ifadesi anlamlı ölçüde değişmiştir. Bu genlerden, 212 genin ifadesinin azalmasına karşın, 105 genin ifadesi yukarı regüle olmuştur. Yolak analizleri C-4 I ve HeLa hücrelerinde apoptoz, WNT ve P53 yolaklarının anlamlı ölçüde teşvik edildiğini göstermiştir. Radyoduyarlı olan C-4 I hücrelerinde gama radyasyonu uygulamasından sonra qRT-PCR sonuçları değerlendirildiğinde BID, BIK, TNFRSF10B, TNFRSF10D, TRAF (2, 3 ve 6), TP53I3, DFFA, SOCS2, SOCS3, NF-kB1, NF-kB2 ve FAM96 faktörlerin ifadesinin yukarı regüle olduğu saptanmıştır. Radyodirencli olan HeLa hücrelerinde ise apoptoz aktivatörleri olarak bilinen BAX, CASP 9, TNFRSF21, TRAF2, NF-kB, STAT, P53 ve diğer faktörlerin ifadesi yukarı regüle olmuştur. Buna karşın, BCL-2 anti-apoptotik genlerin bazıları, apoptoz inhibe edici protein ailesi (IAP) ve diğer üyelerin ifadesi C-4 I ve HeLa hücrelerinde aşağı regüle olmuştur. Çalışmamızın sonunda gama radyasyonunun farklı radyoduyarlılıkta olan serviks kanseri hücre soylarında hücre çoğalması ve apoptoz ile ilişkili genlerin ifadesini değiştirerek antiproliferatif bir etki meydana getirdiği saptanmıştır. Radyasyona direncli HeLa hücreleri ile radyasyona duyarlı C-4 I hücrelerinde apoptoz sinyal yolağında farklı moleküllerin aktive ya da inaktive olması, radyoduyarlılıkta apoptozun önemli bir rol oynadığı sonucunu ortaya konmuştur. Anahtar Kelimeler: Apoptoz; HeLa; C-4 I; qRT-PCR; Mikrodizi