Gökkuşağı Alabalığında (Oncorhynchus mykiss) Germ Hücre İzolasyonu Üzerine Bir Çalışma
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: İstanbul Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Su Ürünleri Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2017
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Sude Atmaca
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Aygül EKİCİ
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu çalışma, ülkemiz iç sularında yetiştiriciliği en fazla yapılan tür olan gökkuşağı alabalığının (Oncorhynchus mykiss) testis dokusundan percoll gradient santrifüj yöntemi ile erken evre germ hücre izolasyonunun gerçekleştirilmesi amacıyla yapılmıştır. Çalışmada İstanbul Üniversitesi Su Bilimleri Fakültesi Sapanca İçsu Ürünleri Üretimi Araştırma ve Uygulama Biriminden temin edilen ortalama 24,76±1,34 cm boy uzunluğunda ve ortalama 171,9±29,10 gram ağırlığındaki 15 adet erkek gökkuşağı alabalığı kullanılmıştır. Balıklara ait testis dokusu enzimatik ayrıştırma amacıyla fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) içerisinde % 0.5 trypsin kullanılarak 2 saat süre ile inkübasyona tabi tutulmuştur. İnkübasyın sonrası örnekler 50 µm'lik filtreden geçirilmiş ve 40 µg/ml Deoxyribonuclease I (DNaz I) ve %1 Bovin Serum Albumin (BSA) eklenmiştir. DNaz, ölü hücrelerden Deoksiribo Nükleik Asitin (DNA) serbest bırakılmasından dolayı ortaya çıkan hücre süspansiyonunun pıhtılaşmasını engellemek ve BSA enzim aktivitesinin durdurulması amacıyla eklenmiştir. Filtrasyon işleminden sonra üç farklı percoll gradient grubu (%45 - %10, %50 - %10 ve %55- %10) oluşturulmuştur. Bu işlem sonrası oluşan herbir katmandaki örnek Olympus CX41 mikroskopta incelenmiştir. Bu inceleme sonucunda santrifüj sonrası oluşan en üst katmanda; debris ve spermatidler, orta katmanda erken evre germ hücreleri ve az miktarda spermatidler, dip katmanda yer alan pelette ise eritrosit ve yoğun olarak spermatidler tespit edilmiştir. Orta katmanda tespit edilen erken evre germ hücreleri DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box Polypeptid 4 Primer Antikoru (DDX4), anti-tavşan IgG- keçide üretilen Floresin İzotiyosiyanat Sekonder Antikoru (FITC) ve 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ile immunofloresan işaretlenmesi sonucunda yalnızca DAPI ile boyanan hücrelere ait görüntüler tespit edilmiştir. DAPI tüm testiküler hücrelere ait nukleusları boyama özelliğine sahip olduğundan hücreler arasında spesifik bir ayrım elde edilememiştir. Testis dokusundan alınan histolojik kesitlerin Hematoksilen-Eosin ile boyanması sonucunda, spermatogonya Tip A ve B ve spermatid hücreleri tespit edilmiştir. Doku kesitlerinin floresan boyanması sonucunda ise primer antikor (DDX4) ve sekonder antikor (FITC) ile işaretlenmiş erken evre germ hücreleri tespit edilmiştir.