Çeşitli Kanser Hücreleri Üzerinde Sitotoksik Etkili Paladyum Türevlerinin Moleküler Etki Mekanizmalarının Aydınlatılması


Öğrenci: Ömer Kaçar

Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Emine Şeküre Nazlı Arda

Eş Danışman: Ceyda Açılan Ayhan

Kanser, dünyadaki ilk üç ölüm nedeninden biridir. Sağlık sistemleri ve araştırma
merkezlerinde kanserle mücadeleye gereken önem verilmesine rağmen, kemoterapide
kullanılan antikanser ilaçların düşük etkinliği ve normal dokular üzerindeki toksisitesi
çözümlenememiş en önemli sorunlardandır. Platin (Pt)-temelli ilaç Cisplatin, 40 yıldan
fazla süredir pek çok solid tümörün tedavisinde kullanılan ve oldukça iyi bilinen
kemoterapötik bir ilaçtır. Cisplatin’in keşfi metal temelli alternatif ilaçların
araştırılmasına hız kazandırmıştır. Paladyum (Pd)-temelli metal bileşikler,, Pt-temelli
olanlara göre suda daha yüksek çözünürlük ve daha düşük nefrotoksisite özellikleriyle
potansiyel antikanser ilaçlar olarak önerilmektedir.
Bu tezde, [PdCl(terpy)](sac).2H2O (Bileşik 1) ve [Pd(sac)(terpy)](sac).4H2O (Bileşik 2)
(terpy = 2,2’:6’, 2’’-terpiridin ve sac=sakkarinat) adı verilen iki yeni paladyum bileşiğinin
antikanser özellikleri araştırıldı. Bileşik 1 için moleküler etki mekanizması aydınlatıldı
ve her iki bileşik için sitotoksik etkinin hücre döngüsü özgüllüğü araştırıldı. İlk olarak,
Bileşik 1 ve Bileşik 2’nin değişik kanser hücre hatları (MDA-MB-231, MCF-7, PC-3,
MDA-MB-435, HeLa ve SH-SY5Y) üzerindeki sitotoksik etkileri IC50 değerleri şeklinde
belirlendi. IC50 değerlerini hesaplamak için Pd(II) bileşikleri uygulanmış hücrelerin
canlılığı MTT (3-(4, 5-dimetilltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolium bromit) ve WST-1 (4-[3-
(4-iodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzen disülfonat sodyum tuzu)
testleriyle belirlendi. Her iki bileşiğin de 24, 48 ve 72 saat için, sırasıyla
25.7±4.3 ⎯ 50< μM, 3.1±0.1 ⎯ 50< μM ve 2.41±0.1 ⎯ 44.61±5.3 μM aralığındaki IC50
değerleriyle kanser hücreleri üzerinde toksik etki gösterdiği bulundu.
xii
MDA-MB-435 ve HeLa hücreleri, Bileşik 1 ile etkileşime cevap olarak ortaya çıkan ölüm
mekanizmasının aydınlatılması için seçildi. Bileşik 1 ile etkileştirildikten sonra
hücrelerde ışık mikroskobuyla büzüşme ve tomurcuklanma gibi morfolojik
değişikliklerin yanı sıra yoğunlaşmış/fragmente olmuş çekirdekler gözlendi. Bu bulgulara
ek olarak, Bileşik 1 uygulanmış hücrelerde ApoTox-Glo™ Triplex kiti kullanılarak
belirlenen kaspaz 3 aktivitesinin arttığı bulundu. Bu sonuçlar, hücre ölümünde ana
mekanizmanın apoptoz olduğunu gösterdi. Apoptozun hangi mekanizmalarla
indüklendiğinin araştırılması amacı ile öncelikle bir in vitro deney gerçekleştirildi. DNA
ile doğrudan etkileştirilen Bileşik 1’in plazmit DNA’sını rastgele olarak kırabildiği
gözlendi. Apoptozda çift zincir kırıkları (ÇZK)’nın rolü olup olmadığını anlamak için bir
ÇZK belirteci olan γ-H2AX birikmesi immünofloresans tekniği ile incelendi. Sonuçlar,
hücrelerde Bileşik 1 uygulaması ile ÇZK meydana geldiğini destekledi.
Bileşik 1 tarafından indüklenmiş DNA hasarının yol açtığı apoptozun meydana
gelmesinde rol oynayan proteinleri araştırmak amacı ile kaspaz 3, p53 ve Bax gibi
apoptozla ilişkili bazı proteinlere ait genler siRNA teknolojisi ile tek tek veya kombine
şekilde susturuldu. Bu genlerin susturulması ile apoptoz engellenemedi. Bileşik 1 ile
işleme sokulmuş hücrelerde kaspaz 3 aktivitesi yükselirken, geninin susturulması
apoptozu durdurmadı. Kaspaz 3 aktivitesinin spesifik inhibitörü olan DEVD ile
inhibisyonu da apoptoz üzerinde olumsuz bir etki göstermedi. Bu sonuçlar Bileşik 1’in
kaspaz 3, p53 veya Bax’tan bağımsız şekilde apoptozu indükleyebildiğini ve bu genler
için mutant olan kanser hücrelerinde dahi sitotoksik bir ajan olarak kabul edilebileceğini
düşündürdü.
Hücre döngüsüne özgüllüklerini ortaya koymak için Pd(II) bileşikleri, senkronize edilmiş
hücrelerin üzerine de uygulandı. Hücreleri farklı fazlarda senkronize etmek için çeşitli
ajanlar (mimozin, afidikolin G1/S için, çift timidin bloğu S için, nokodazol ve kolsemid
G2/M için) kullanıldı. Senkronizasyon, morfolojik gözlemler ve akış sitometrisi ile
kontrol edildi. Hücrelerin, hücre döngüsü fazlarında tutulması başarıyla sağlandı;
devamında bu hücreler Pd(II) bileşikleri ile işleme sokuldu. HCT-116 ve MDA-MB-231
hücreleri için ölüm fazında hiçbir belirgin varyasyon bulunmadığı halde G1/S fazındaki
HeLa hücrelerinin her iki bileşiğe 24 saatlik uygulama için az da olsa duyarlı olduğu
gözlemlendi.
Sonuç olarak bu çalışmada araştırılan Pd(II) bileşikleri, HeLa, MCF-7, MDA-MB-231,
PC-3, MDA-MB-435 ve SH-SY5Y hücre hatlarında apoptozu indükledikleri için,
servikal, meme, prostat ve beyin kanserlerine karşı potansiyel antikanser ajanlar olarak
kabul edilebilir. Yeni kemoterapötiklerin keşfi veya değişik antikanser ilaçların kombine
olarak kullanılması kanser tedavisine olumlu katkı yapabilir. Dolayısıyla, bu tez
çalışmasında araştırılan Pd(II) bileşiklerinin de konvensiyonel antikanser ilaçlarla
kombine edilerek kullanıldığında kanser tedavisine olumlu katkı yapıp yapmayacağı
gelecek çalışmaların konusu olabilir. Her durumda, daha ileri araştırmalar için bu Pd(II)
bileşiklerinin fazla miktarlarda sentezlenmesine ihtiyaç vardır.