İnfertil erkeklerde paternal kalıtımla ilişkili endog geninin analizi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: İstanbul Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Fen Fakültesi Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: MEHMET ULAŞ BİLİR
Danışman: Tuba Günel
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Dünya çapındaki çiftlerin yaklaşık %15'i infertiliteden etkilenmektedir ve üreme başarısızlıklarının yaklaşık %50'si erkek faktöründen kaynaklanmaktadır. Erkek infertilitesinin nedenleri çok farklı değişkenlere bağlı olmakla birlikte, genelde spermatogenezi etkileyen nedenler; idiyopatik, konjenital, edinsel veya sebebi bilinmeyen faktörlerdir. Kişinin yaşı, ameliyat geçmişi, kullandığı ilaç, çevresel dış toksinlere maruz kalmaları, sistemik hastalıklar ve mitokondri fonksiyonu da dahil birçok sağlık durumu erkek doğurganlığını doğrudan veya dolaylı şekilde etkileyebilir. Sperm ve mitokondri ile yapılan çalışmalarda, spesifik mtDNA delesyonları, yetersiz sperm fonksiyonu ile ilişkilendirilmiştir. Mitokondriyal mutasyonlar azospermiye sebep olabileceği gibi "Intra Sitoplazmik Sperm Enjeksiyonu" (ICSI) gibi yardımcı üreme yöntemlerinin de sperm mtDNA'larını aktarabileceği gösterilmiştir.İnsanda ve memelilerde mitokondri ve mitokondriyal DNA'nın maternal kalıtımı yaygın olarak kabul gören bilimsel görüştür. Preimplantasyon sürecinde sperm kaynaklı mitokondrilerin eliminasyonu sağlıklı embriyo gelişiminde işleyen biyolojik süreçtir.ENDOG (endonukleaz G), DNA ve RNA'yı parçalayan, nüklear üretilen, mitokondride lokalize bir nükleazdır. Apoptoz, erken embriyogenez, paternal mitokondriyal eliminasyon ve otofaji dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde yer almaktadır. ENDOG proteini, mtDNA ile yakın etkileşim içerisinde olması nedeniyle mtDNA replikasyonu, metabolizması ve onarımına katılır. ENDOG geni kopya sayısının azospermi hastalarından elde edilen DNA örneklerinde düşük olması, infertil erkekler üzerinde araştırılmasının önemini arttırmıştır.Tez kapsamında azospermi hastalarında nükleer genomda lokalize olan ENDOG geni üzerindeki varyasyonların mitokondrinin paternal eliminasyondaki rolü ve implantasyon başarısındaki etkisi araştırılmıştır. Azospermi tanısı alan 25 infertil erkek hasta ve 25 sağlıklı erkekten elde edilen periferik kan örneklerinden total genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. Hedefe yönelik yeni nesil dizileme teknolojilerinden "Illumina NextSeq 550" platformuna özgü dizileme prosedürü takip edilerek, toplam 50 ENDOG geni DNA dizilemesi gerçekleştirilmiş, Referans veri tabanlarında analiz edilerek sonuçlar hasta-kontrol grupları arasında değerlendirilmiştir. Ayrıca, periferik kanlardan elde edilen genomik DNA örneklerinde mitokondriye ait olan mt-ND1 geni kullanılarak kantitatif real-time PCR yöntemiyle mtDNA kopya sayısı belirlenmiştir. Mitokondriyal kopya sayısının, infertil hasta grubunda implantasyon başarısına etkisi, infertil-fertil grubu arasında ise fertilite durumlarına göre etkisini ortaya koymak üzere analizleri gerçekleştirilmiştir.ENDOG dizilemesine ilişkin ham veri bilgisinden, verilerin görünebilir hale getirilmesi için kullanılan algoritmalara, web-temelli açık erişim sunan "Galaxy" biyoenformatik platformu aracılığıyla ulaşılmıştır. NGS cihazından elde edilen 25 hasta ve 25 kontrol örneğine ait ham dizileme verisi, Bowtie2 (Galaxy Version 2.5.0+galaxy0) algoritması ile referans insan genomuna [Human (Homo sapiens) (b38): hg38] karşı hizalanarak "BAM (Binary Alignment Map – İkili Hizalama Haritası)" formatında veri setleri elde edilmiştir. Genomik veriler Integrative Genomics Viewer (IGV) uygulaması kullanılarak, indekslenmiş BAM dosyalarından referans insan genomuna (hg38) karşı hasta ve kontrol örneklerine ait yapısal genetik varyant analizi yapılmış ve sonuçlar kaydedilmiştir. ENDOG dizileme verileri 25 infertil ve 25 fertil erkek olguda karşılaştırıldığında 11 farklı varyant elde edilmiştir. Bu varyantlardan dördü "novel" varyant, yedisi dbSNP ID'leri bulunan varyantlardır. ID'leri bulunmayan "novel" varyantlardan ikisi ENDOG geninin "upstream" bölgesinde, biri "terminatör" diğeri ise "intron" bölgesindedir. Veritabanında dbSNP ID bulunan 7 varyanttan üçü "ekson" (rs74750652, rs959785492, rs2280844) dördü intron (rs56778081, rs1217568273, rs112269930, rs569132609) bölgesinde görülmektedir. İnfertil ve fertil erkeklerde ortak olarak 29 varyant tespit edilmiş; bunlardan dördü ise alkolik olmayan karaciğer hastalığı ve lösemi (rs2977998), kolorektal tümör lezyonları (rs2997922), kardiyovasküler risk (rs2293969) ve yaşa bağımlı immün sistemi etkileyen (rs2280845) çeşitli hastalıklarla ilişkili olarak bildirilmiştir. İnfertil erkek olgularda gerçekleştirilen mitokondriyal kopya sayısı analizlerinde başarısız implantasyon olgularına ait relatif kopya sayısı 2.3, başarılı olgularda ise relatif kopya sayısı 0.70 bulunmuş ve istatistiksel olarak anlamlı (p<0.5) tespit edilmiştir. Tek bir olguda ise mitokondriyal delesyon ve bu olguya özgü "novel" ENDOG varyasyonu bulunmuştur.Sadece infertil erkeklerde ENDOG geni üzerinde saptadığımız varyantların paternal mitokondriyal eliminasyon mekanizmasında etkin olabileceğini, özellikle tek bir olguda saptanan mitokondri delesyonuyla bu olguda "novel" bir varyasyonun bulunması, mitokondrilerinin embriyolarda eliminasyon mekanizmalarından kaçarak paternal sızıntıya sebep olabileceğini düşünmekteyiz. Aynı zamanda in vitro fertilizasyonun başarı oranını da etkileyeceği için mitokondrilerin karar verme kriterleri arasına girmesinin önemini göstermektedir.